Platform Penanganan Cairan Otomatis Lab GILSON PIPETMAX 268
MANFAAT
- Otomatisasi pada PIPETMAX® 268 menyederhanakan proses, membuat pemurnian PCR lebih andal dan dapat direproduksi.
- Pemisah manik magnetik khusus memungkinkan pemurnian cepat hingga 96 detikampdalam satu kali proses, sehingga meningkatkan efisiensi.
- Protokol otomatis bersifat fleksibel dan dapat disesuaikan, memungkinkan pengguna untuk menyesuaikan variabel agar sesuai dengan alur kerja dan aplikasi yang berbeda
MASALAH YANG DITANGANI
- Pemurnian PCR sering kali melelahkan dan menantang secara teknis, memerlukan upaya manual dan ketelitian.
- Batasan penanganan manual sampthroughput yang rendah, sehingga memakan waktu lama untuk memproses beberapa sampsedikit.
- Protokol mungkin kurang fleksibel, dengan kemampuan terbatas untuk menyesuaikan parameter seperti volume, pencucian, atau waktu inkubasi.
PERKENALAN
- Pemurnian PCR ampLicons diperlukan untuk beberapa aplikasi hilir, termasuk Sanger dan pengurutan generasi berikutnya (NGS), genotipe, deteksi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP), kloning, analisis fragmen, dan primer walking. Prosedur pembersihan ini menghilangkan primer, nukleotida tak terikat, garam, dan enzim, yang penting untuk DNA. amplifikasi, tetapi dianggap sebagai kontaminan untuk banyak reaksi hilir1.
- Ada beberapa pendekatan untuk memurnikan PCR ampberbagai metode, termasuk penggunaan gel agarosa, kolom putar, ujung fungsional, pencernaan enzimatik, dan manik magnetik. Setiap pendekatan dapat memenuhi kebutuhan spesifik (biaya, kecepatan, kualitas), namun manik magnetik umumnya digunakan untuk aplikasi NGS karena lebih mudah diotomatisasi dan mudah diskalakan²,³. Illumina secara khusus merekomendasikan penggunaan Agencourt® AMPSistem pemurnian PCR ure® XP untuk langkah pembersihan dalam alur kerja Persiapan Pustaka DNA Nextera® XT (Gambar 2). Banyak alur kerja persiapan pustaka NGS yang menggunakan AMPpembersihan manik ureXP, termasuk Ion Torrent,
- Roche, KAPA, BioLabs New England dan TATAA.
- Itu AMPSistem pemurnian PCR ure XP menggunakan manik paramagnetik imobilisasi reversibel fase padat (SPRI) dalam buffer yang dioptimalkan untuk mengikat fragmen yang lebih besar dari 100 bp secara selektif. Tahap pencucian selanjutnya menghilangkan komponen PCR yang tidak diinginkan sebelum tahap elusi akhir menghasilkan PCR murni. ampsinga.
Gambar 2
Alur kerja persiapan Pustaka DNA Illumina Nextera® XT. Sampfile diproses melalui rute standar; tagpemikiran, amplifikasi, bersihkan menggunakan AMPsistem ure® XP, normalisasi, dan penggabungan, sebelum beralih ke pengurutan- Metode otomatis yang dijelaskan di sini digunakan untuk membersihkan pustaka gDNA E. coli sebelum pengurutan genom utuh. Protokol PIPETMAX 268 menggunakan pemisah manik magnetik khusus (nomor komponen SPL-2294), yang memungkinkan pengguna memproses hingga 96 detik.amples per run (Gambar 3).
- Pemisah manik magnetik khusus (nomor komponen SPL-2294) berisi 24 magnet yang dapat dinaikkan atau diturunkan agar bersentuhan langsung dengan pelat 96 sumur. Setiap magnet diposisikan di antara empat sumur, menarik manik-manik magnetik ke sudut setiap sumur.
BAHAN DAN METODE
Pembangunan Perpustakaan
- Perpustakaan NGS dibuat dari gDNA E. coli K12, menggunakan Persiapan Perpustakaan DNA Nextera® XT
- Kit (nomor komponen Illumina FC-131-1005) pada PIPETMAX 268 sesuai dengan spesifikasi pabrikan4. Dua belas set primer unik digunakan untuk menyiapkan gDNAamples (1 ng pada 0.2 ng/uL) berikut tagpemikiran.
AMPProtokol Otomatis ure XP
Nilai default digunakan untuk semua variabel protokol, kecuali untuk Library Wells yang akan Diproses (Gambar 4).
- Antarmuka pengguna untuk memodifikasi variabel seperti Sumur Perpustakaan yang akan Diproses, Sample Transfer Volume, AMPVolume Transfer ure® XP Beads, Langkah Pencucian, dll.
- Semua peralatan laboratorium dan reagen ditempatkan pada tempat tidur PIPETMAX 268 pada awal pengujian, termasuk ujung (DSF200ST, nomor komponen F172513), pelat PCR (nomor komponen Eppendorf 0030 128.575) setiap sumur berisi 50 µL ampperpustakaan terlampir dalam basis pendukung (nomor komponen Applied Biosystems N8010531), reservoir cairan (nomor komponen Seahorse 201256-100) yang berisi 2 mL AMPmanik-manik XP ure (nomor komponen Beckman Coulter A63881) dan 10 mL etanol 80%, 0.2 mL MikroAmp Strip 8 tabung (nomor komponen Applied Biosystems N8010580) yang masing-masing tabung berisi 95 µL buffer resuspensi RSB, pelat MIDI kosong (nomor komponen Thermo AB-0859) pada alas, dan pelat lainnya pada pemisah manik magnetik (nomor komponen SPL-2294J dan SPL-2294E) (Gambar 5).
- Antarmuka pengguna untuk tata letak tempat tidur pada PIPETMAX 268. Peralatan laboratorium dan reagen dari kiri ke kanan, belakang ke depan: Saluran Limbah Ujung, Rak Ujung DSF200ST, Rak Ujung DSF200ST, penyangga Resuspensi RSB dalam Strip 8-Tabung 0.2mL, pelat MIDI kosong untuk perpustakaan elusi akhir, reservoir cairan berisi AMPmanik-manik ure® XP dan 80% Etanol, bahan awal (ampPerpustakaan Terpadu, Rak Tip DSF200ST, dan pelat MIDI kosong lainnya pada pemisah manik magnetik untuk prosedur pembersihan.
- AMPManik-manik XP (24 µL) telah dicampur terlebih dahulu dan dipindahkan ke dua belas sumur pelat MIDI pada pemisah manik magnetik. Dua belas sumur ampperpustakaan terlifikasi (40 µL) ditransfer oleh PIPETMAX 268 ke pelat MIDI yang berisi AMPmanik XP dan dicampur. Pemisah manik magnetik diaktifkan, membuat magnet bersentuhan dengan pelat MIDI dan menarik manik-manik ke bawah. Setelah menunggu sebentar,
Supernatan dikeluarkan dari setiap sumur dan dibuang. Kemudian, manik-manik dicuci dua kali dengan menambahkan larutan pencuci (200 µL etanol 80%) dan dibuang ke tempat pembuangan. Manik-manik dibiarkan mengering di udara selama 15 menit untuk menghilangkan sisa etanol. Pemisah manik magnetik dilepaskan, menghilangkan medan magnet dari pelat MIDI sebelum RSB (42 µL) ditambahkan ke setiap perpustakaan dan dicampur. Terakhir, Pemisah Manik Magnetik diaktifkan, membuat magnet bersentuhan dengan pelat MIDI dan menarik manik-manik ke bawah, dan perpustakaan yang telah dibersihkan dipindahkan ke pelat MIDI yang baru.
Analisis Ukuran Fragmen
Setelah pembersihan PCR, ukuran fragmen DNA dinilai untuk sampkualitas dan konsistensi. Sejumlah kecil (1 µL) setiap sample dimuat ke dalam chip elektroforesis dan dianalisis oleh Agilent 2100 Bioanalyzer, menghasilkan jejak elektroforogram untuk setiap sampsaya.
HASIL DAN DISKUSI
- Agencourt AMPSistem pemurnian PCR ure XP digunakan untuk membersihkan pustaka gDNA E. coli K12 untuk pengurutan genom keseluruhan sebagai bagian dari proses Persiapan Pustaka DNA Illumina Nextera® XT.
- Protokol ini dilakukan pada PIPETMAX 268 dengan menggunakan pemisah manik magnetik. Jejak elektroforesis menunjukkan kualitas tinggiampSebagian besar fragmen terdiri dari antara 700 dan 2000 pasangan basa tanpa kontaminasi yang dapat diamati (Gambar 6).
- Elektroferogram fragmen gDNA E. coli K12, diproses dengan Nextera® XT DNA Library Preparation Kit dan dibersihkan dengan AMPSistem pemurnian PCR ure® XP pada PIPETMAX 268.
- Skrip PIPETMAX 268 otomatis dapat dimodifikasi dengan cepat dan mudah agar sesuai dengan berbagai alur kerja dan kebutuhan aplikasi, dengan menyesuaikan variabel waktu proses (Tabel 1). Variabel untuk SampBahan yang akan diproses, volume untuk setiap reagen, jumlah pencucian, dan volume elusi disertakan untuk memberikan solusi yang sangat fleksibel.
Tabel 1
Variabel yang Dapat Disesuaikan pada Waktu Proses untuk Skrip PIPETMAX 268 Otomatis untuk Agencourt® AMPSistem Pemurnian PCR ure® XP
| VARIABEL | UNIT | BAWAAN | INFORMASI |
| Sumur Perpustakaan Akan Diproses | Tidak tersedia | A1:H12 | Sumur dalam pelat MIDI digunakan untuk membersihkan reaksi PCR. |
| Sample Volume Transfer (µL). | L | 40 | Volume reaksi PCR yang akan dipindahkan ke pelat MIDI untuk prosedur pembersihan. |
| AMPVolume Transfer Manik-manik ure® XP | L | 24 | Volume manik-manik yang akan dipindahkan ke pelat MIDI untuk prosedur pembersihan. |
| Waktu Inkubasi | menit | 5 | Jumlah waktu yang memungkinkan samples dan manik-manik untuk diinkubasi pada suhu ruangan untuk pengikatan awal. |
| Langkah-Langkah Pencucian | Tidak tersedia | 2 | Jumlah kali pencucian reaksi PCR. |
| Volume Transfer Cucian | L | 200 | Volume larutan pencuci yang akan dipindahkan ke pelat MIDI untuk setiap langkah pencucian. |
| Waktu Pengeringan Udara | menit | 15 | Jumlah waktu yang memungkinkan sampLarutan dan manik-manik diinkubasi pada suhu ruangan agar etanol yang tersisa dapat menguap. |
| Tabung Penyangga Elusi untuk Digunakan | Tidak tersedia | 1:8 | Tabung yang berisi buffer elusi. |
| Volume Transfer Buffer Elusi | L | 42 | Volume buffer elusi yang akan ditransfer ke pelat MIDI untuk langkah elusi akhir. |
| Perpustakaan Elute ke Plat Baru | Tidak tersedia | BENAR | Setelah menambahkan buffer elusi, secara opsional pindahkan Volume Elusi Akhir ke pelat baru. |
| Volume Transfer Elusi Akhir | L | 20 | Volume elusi sample untuk pindah ke plat baru di akhir protokol. |
INFORMASI PEMESANAN
| NOMOR BAGIAN | KETERANGAN |
| 32100001 | PIPETMAX 268 dengan Potongan Penutup |
| FC10021 | Kepala Pipet MAX8x200 |
| FC10022 | Kepala Pipet MAX8x20 |
| 32000091 | PIPETMAX 268 Baki 384 Sumur. |
| 32000175 | Blok Adaptor Ujung PIPETMAX 268 (x 3) |
| 32000321 | TRILUTION® mikro Terpasang pada |
| 32000177 | Riser Penyimpanan Ujung untuk PIPETMAX 268 |
| SPL-2294J-HDW | Rak Pemisah Manik Magnetik |
| SPL-2294E-HDW | Pemisah Manik Magnetik Magnet |
| 40000026 | Sekrup Jempol (x 6) |
| 32000292 | Klip Blok Isi Ulang (x 4) |
| 4214540393 | Mesin cuci (x 4) |
| 32000303 | Mikroamp Rak Tabung PCR Pendek 96 |
| F172513 | Mata Bor Berlian DSF200ST dalam Kemasan Blister |
KESIMPULAN
- Pustaka gDNA E. coli K12 disiapkan untuk pengurutan genom keseluruhan sebagai bagian dari kit Persiapan Pustaka DNA Illumina Nextera XT.
- Agencourt AMPSistem pemurnian PCR ure XP umumnya digunakan untuk langkah pembersihan dalam alur kerja Next Generation Sequencing.
- Catatan aplikasi ini menunjukkan protokol PIPETMAX 268 yang diotomatisasi, yang menggunakan pemisah manik magnetik.
- Variabel memungkinkan pengguna untuk memodifikasi protokol pada waktu proses, menciptakan solusi dinamis untuk prosedur yang membosankan dan menantang secara teknis.
REFERENSI
- Agencourt® AMPPanduan Penggunaan ure® XP, Pemurnian PCR. PN B37419AA. AS: 2013. Cetak.
- Head, S., Komori, HK, LaMere, SA, Whisenant, T., Van Nieuwerburgh, F., Salomon, DR, dan Ordoukhanian, P. Konstruksi perpustakaan untuk pengurutan generasi berikutnya: Selesaiviewdan tantangan. BioTechniques., 56: 61-77 (2014).
- Bronner, IF, Quail, MA, Turner, DJ, Swerdlow, H. Protokol yang Disempurnakan untuk Pengurutan Illumina. Curr Protoc Hum Genet., 18.2, (2009).
- Panduan Referensi Persiapan Pustaka DNA Nextera® XT. 15031942 v01. San Diego, CA, AS. 2016. Cetak.
Merek Dagang
Semua nama produk dan perusahaan adalah merek dagang™ atau merek dagang terdaftar® dari masing-masing pemiliknya. Penggunaan merek dagang dalam dokumen ini tidak menyiratkan afiliasi atau dukungan apa pun dari pemegang merek dagang tersebut.
Melihat
Catatan aplikasi ini telah dibuat dan diedit menggunakan informasi yang tersedia pada saat publikasi. Catatan aplikasi ini dapat direvisi tanpa pemberitahuan sebelumnya.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pekerjaan ini dilakukan oleh tim Aplikasi Gilson, WI, AS, dan Branedon Converse, Lucigen,
- WI, Amerika Serikat.
- www.gilson.com/contactus
Tanya Jawab Umum
Aplikasi hilir apa yang dapat dilakukan menggunakan PCR murni? amplisensi?
PCR yang dimurnikan amplicons sangat penting untuk Sanger dan pengurutan generasi berikutnya, genotipe, kloning, analisis fragmen, dan primer walking.
Berapa sampfile dapat diproses per proses dengan pemisah manik magnetik khusus?
Pemisah manik magnetik khusus memungkinkan pemrosesan hingga 96 detikamples dalam satu kali jalan.
Apa teknologi yang digunakan di AMPapakah sistem pemurnian PCR XP?
Sistem ini memanfaatkan manik paramagnetik imobilisasi reversibel fase padat (SPRI) untuk secara selektif mengikat fragmen PCR yang lebih besar dari 100 bp.
Dokumen / Sumber Daya
 |
Platform Penanganan Cairan Otomatis Lab GILSON PIPETMAX 268 [Bahasa Indonesia:] Instruksi Platform Penanganan Cairan Otomatis Laboratorium PIPETMAX 268, PIPETMAX 268, Platform Penanganan Cairan Otomatis Laboratorium, Platform Penanganan Cairan Otomatis, Platform Penanganan Cairan, Platform Penanganan |